Jul 14, 2023
基本的かつ測定可能な分光特性に関連した発光粒子の散乱効率スケール
Scientific Reports volume 13、記事番号: 6254 (2023) この記事を引用 547 アクセス メトリクスの詳細 分子およびナノスケールの発光団と発光マイクロおよび発光体の性能の比較
Scientific Reports volume 13、記事番号: 6254 (2023) この記事を引用
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メトリクスの詳細
分子およびナノスケールの発光団と発光マイクロ粒子およびナノ粒子の性能を比較し、達成可能な信号振幅と検出限界を推定するには、標準化可能な強度スケールが必要です。 これにより、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡用の相対 MESF (同等の可溶性蛍光色素の分子数) および ERF (同等の参照蛍光色素分子) スケールの開発が始まりました。 どちらの強度スケールも、分光蛍光光度計を使用して、スペクトル的に厳密に一致する既知の濃度の蛍光団溶液との強度比較によって、蛍光キャリブレーション ビーズに割り当てられた蛍光強度値に依存します。 あるいは、励起波長 (σa(λex)) での吸収断面積 (σa) とフォトルミネッセンス量子収率 (Φpl) の積に等しい発光団またはビーズの輝度 (B) を決定することもできます。 これにより、粒子サイズ、材料、発光団の染色または標識密度に依存せず、環境に対する発光団の光学特性の感度を考慮した、基本的で測定可能な分光特性に基づく絶対スケールを実現できます。 数十ナノメートルを超えるサイズの発光粒子の光散乱分散体に対するそのような輝度スケールを確立することを目的として、我々は、準単分散の25nm、100nm、および1μmサイズのポリスチレン粒子（PSP）の輝度がどのように変化するかを実証する。さまざまな濃度の 2 つの異なる色素を単一のカスタム設計の積分球セットアップで得ることができ、Φpl、透過率、拡散反射率の絶対測定が可能になります。 これらのサンプルの結果として得られるΦpl、σa(λex)、屈折率の虚部、および計算されたB値は、粒子ごとに組み込まれた色素分子の数に応じて与えられます。 最後に、単位のない発光効率 (LE) が定義され、異なるサイズの粒子の発光効率を直接比較できるようになります。
過去数十年にわたり、さまざまな種類の分子およびナノ結晶発光団で染色またはコード化されたナノ粒子 (NP) および微粒子 (MP) が、生命科学および材料科学で使用されることが増えています。 一般的なアプリケーションは、蛍光アッセイ、バイオイメージング、薬物送達システム用の光学レポーターから、印刷可能な認証タグ、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、免疫分離用のビーズベースのプラットフォームから、さまざまな蛍光法、特にフローサイトメトリー用の粒子センサーやキャリブレーションツールまで多岐にわたります1 、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13。 蛍光分光法、顕微蛍光測定法、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリーなど、発光 NP および MP を利用するほとんどの蛍光法は、機器固有の相対蛍光強度のみを測定します 14。 異なる機器および異なる研究室間の蛍光測定値を信頼性高く比較するには、測定された発光スペクトルに影響を与える、機器の検出チャネルの波長依存スペクトル応答性などの機器固有の信号の寄与を決定および考慮するための機器のキャリブレーションが必要です15、16。 例えば、検体の定量化や、異なる蛍光技術を用いた異なる蛍光サンプルの比較では、一般に、既知の濃度、発光特性、特に発光スペクトルと厳密に一致する発光スペクトルの蛍光体溶液を使用して、蛍光強度スケールの相対的な校正が実行されます。サンプルの測定に適用されたものと同じ機器設定を使用するサンプル17。 これは、蛍光検出を備えた高速液体クロマトグラフィー (HPLC) などのクロマトグラフィー分離技術によるセンシング用途や発光団の定量など、透明な発光サンプルでは簡単ですが、光散乱システムでは困難です。 ただし、広く使用されている蛍光 NP および MP の分散体のほとんどは、粒子のサイズ、屈折率、および環境に応じて励起光を散乱します。 これは、蛍光分析による特性評価、特に透明サンプルの測定用に設計された一般的な分光光度計や分光蛍光光度計を使用した吸収特性の測定に影響を与える可能性があります。
0). The normalized absorbance and emission spectra of aqueous dispersions of these differently sized PSP loaded with Nile Red and Itrybe are displayed in the SI in Fig. S5. Due to the dye staining of the particles via a previously optimized swelling procedure assessed, e.g., microscopy, the dye molecules can be assumed to be homogeneously distributed within the particles, and the spherical shape of the particles is preserved in the process.12,41,42,44 This allows for a data analysis based on Mie Theory, like with the unstained particles discussed above. The absorbance and emission spectra of Itrybe-loaded PSP are broadened compared to the parent molecule in ethanol, yet the respective absorption and emission maxima match. In the case of solvatochromic Nile Red, the absorbance and emission bands of Nile Red-stained PSP are red shifted with decreasing PSP size, pointing to an increasingly polar microenvironment faced by the dye molecules with reduced PSP size and hence increased surface-to-volume ratio. The corresponding \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) of aqueous dispersions of Nile Red- and Itrybe-loaded PSPs in dependence on PSP size and loading concentration, i.e., the average dye-dye distance are shown in Fig. 4. This figure reveals opposite trends for the particle size- and dye loading-dependent \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) of both dyes. As shown in the left panel of Fig. 4, the \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) values of Nile Red-stained PSP decreased with decreasing PSP size and increased surface-to-volume ratio. In contrast, for PSP containing Itrybe molecules, \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) decreased with increasing particle size (right panel of Fig. 4. For both dyes, an increase in dye loading concentration resulted in a diminution of \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) (see also SI, Fig. S7). We attribute these trends to (1) the influence of the polar particle environment particularly in the case of the charge transfer dye Nile Red, the fluorescence of which is known to be quenched by hydrogen bonding interactions and polarity as follows also from the solvatochromic emission behavior of Nile Red (see SI, Fig. S5), (2) dye-dye interactions, and (3) energy transfer processes between dye molecules in the PSP. The latter two factors are supported by the dependence of \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) on dye loading concentration (see Fig. 4 and SI, Fig. S7)66,67,68,69,70. µa(λ) and µs(λ) of the dispersed 1 µm and 100 nm dye loaded PSPs determined by radiation transport and Mie Theory are shown in Fig. 5. For the 25 nm sized particles the scattering contributions were too small to be used for quantification and represent the physical size limit for our study and method development. For the fit of µa(λ) and µs(λ), we considered the contribution of the dye molecules to the dielectric function of the particle matrix by increasing the imaginary part of the refractive index. In a first step, n2 was used as a free variable and it was assumed that the particle matrix is homogeneously loaded with dye molecules. The resulting σa(λ) values are shown in Fig. 6. The resulting Np and rp values were also used for the determination of σa(λ) from µa(λ) calculated from the radiation transport theory. For the particle sizes and dye concentrations used here, the direct determination of σa(λ) from Mie calculations and calculations using radiation transport theory are in good agreement as displayed in Fig. 5./p>3.0.co;2-i" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28sici%291097-0320%2819960315%2926%3A1%3C22%3A%3Aaid-cyto4%3E3.0.co%3B2-i" aria-label="Article reference 18" data-doi="10.1002/(sici)1097-0320(19960315)26:13.0.co;2-i"Article CAS PubMed Google Scholar /p>3.0.CO;2-X" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-0320%2819981001%2933%3A2%3C213%3A%3AAID-CYTO16%3E3.0.CO%3B2-X" aria-label="Article reference 22" data-doi="10.1002/(SICI)1097-0320(19981001)33:23.0.CO;2-X"Article CAS PubMed Google Scholar /p>3.0.co;2-q" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28sici%291097-0320%2819981001%2933%3A2%3C188%3A%3Aaid-cyto13%3E3.0.co%3B2-q" aria-label="Article reference 23" data-doi="10.1002/(sici)1097-0320(19981001)33:23.0.co;2-q"Article CAS PubMed Google Scholar /p>
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